【摘要】 目的 探讨过氧化物酶体增殖物活化受体γ（PPARγ）在胃癌及癌前病变中的表达，研究PPARγ激动剂曲格列酮（troglitazone,TGZ）对人胃癌细胞SGC7901生长抑制作用及其作用机制。方法 免疫组织化学方法检测PPARγ在胃癌及癌前病变中的表达；体外培养SGC7901细胞给予TGZ干预，四甲基偶氮唑蓝（MTT）法、流式细胞术、苏木精-伊红染色、免疫细胞化学方法、Western blot检测TGZ作用后SGC7901细胞生长情况、凋亡率及细胞周期的改变、细胞形态学变化、PPARγ表达情况。结果 ①免疫组化染色结果显示在轻度不典型增生、重度不典型增生及胃癌标本中PPARγ阳性表达率为15.15％（5/33）、66.67％（14/21）、71.43％（60/84），轻度不典型增生与重度不典型增生及胃癌组间有统计学差异（P＜0.05）。②体外实验结果显示SGC7901细胞与不同浓度的TGZ共同培养，细胞的生长受到不同程度的抑制，TGZ 50 μmol/L组与对照组相比P＜0.05，同时其作用具有浓度及剂量依赖性，苏木精-伊红染色结果显示实验组肿瘤细胞的生长较阴性对照组逐渐稀疏，出现细胞体积变小、形态不规则、细胞皱缩、核固缩、胞浆空泡等形态学表现。免疫组织化学染色显示PPARγ在SGC7901细胞中有较高表达，50 μmol/L与阴性对照组及低浓度25μmol/L组相比P＜0.05，流式细胞仪检测结果显示TGZ 25 μmol/L组起作用72 h后，细胞凋亡率明显升高，处于G0/G1与S期的细胞比例与阴性对照组相比，具有统计学意义（P＜0.05）。Western blot结果显示 TGZ作用72 h后与阴性对照组相比，高浓度50 μmol/L组PPARγ表达增加（P＜0.01）。结论 应用TGZ可以将SGC7901细胞阻滞于G0/G1期，进而抑制其增殖。 【关键词】 过氧化物酶体增殖物活化受体γ; SGC7901胃癌细胞; 曲格列酮 过氧化物酶体增殖物活化受体（peroxisome proliferators-activated receptor, PPAR）属于核受体超家族成员，是一类由配体激活的核转录因子；人类PPAR有3种亚型，分别为PPARα、PPARβ/δ、PPARγ［1］。研究发现PPARγ在脂肪肉瘤、乳腺癌、结肠癌、肺癌等肿瘤组织和细胞系中有较高水平的表达，但是研究同时显示PPARγ激动剂能诱导胃癌细胞、结肠癌细胞株分化，抑制肿瘤细胞增殖，促进肿瘤细胞凋亡［2-4］。目前，对于PPARγ在胃癌发生发展中的具体作用尚不明确。本研究在通过免疫组织化学方法检测PPARγ在胃癌中的表达的同时，体外培养人胃癌SGC7901细胞给予PPARγ激动剂干预后检测胃癌细胞增殖的改变，以探讨PPARγ在胃癌发生发展中的作用。 1 材料和方法 1.1 PPARγ在胃癌及癌前病变中的表达 1.1.1 标本来源 所有标本取自徐州医学院附属医院2001～2004年胃镜活检及手术切除标本。84例胃癌中男性 61例,女性 23例,年龄31～77岁,平均 57.5岁,有淋巴结转移 56例。不典型增生标本中,轻度不典型增生 33例,重度不典型增生 21例。所有胃癌患者术前均未经过化疗和放疗。 1.1.2 试验方法 采用免疫组化PowerVision两步法进行染色 (按试剂盒说明书进行,抗原修复均采用高压热修复 )。用 PBS取代一抗作为空白对照 ,已知阳性组织片作为阳性对照。PPARγ购自北京中杉试剂公司（美国Santa Cruz公司产品，sc-6285）。PPARγ主要定位于细胞核，染色后光镜观察免疫组化染色切片的显色反应，高倍镜下计数10个高倍视野，阳性细胞计数>10% , 判定为阳性。 1.2 体外实验 体外培养人胃癌SGC7901细胞（购自上海细胞生物学研究所），给予PPARγ激动剂曲格列酮（troglitazone，TGZ，美国Cayman公司）干预后检测胃癌细胞增殖、细胞周期及凋亡的改变。 1.2.1 实验分组 以DMSO液体配成浓度100 mmol/L，-20℃保存备用。TGZ作用浓度分为6组：0、6.25、12.5、25、50、100 μmol/L共6个剂量组。四唑蓝比色试验按照上述分组进行，根据MTT结果挑选出第1、4、5组进行苏木精-伊红染色、免疫组织化学染色、Western blot 检测蛋白表达及流式细胞仪检测细胞凋亡及细胞周期。 1.2.2 四唑蓝比色试验（MTT法） 取SGC7901细胞1×108/L接种于96孔培养板,每孔200 μl，置37℃、5%CO2及饱和湿度条件下待24 h细胞贴壁生长后，弃上清，按照上述实验分组设计分别加入含有TGZ的培养液，每组设6个复孔，重复2板，分别培养至48 h、72 h，弃上清，每孔加入5 g/L MTT液20 μl，4 h后每孔加入150 μl DMSO振荡混匀，酶标仪测定490 nm处的吸光度，计算抑制率。抑制率=（1－给药组D值/空白组D值）×100%。 1.2.3 苏木精-伊红染色 用1640培养液稀释肿瘤单细胞悬液浓度至2×105/ml，以每孔1 ml单细胞悬液接种于6孔板中，培养板每孔内放置3枚直径10 mm的圆形盖玻片。按照实验分组设计，每组每孔分别加入含有TGZ的培养液各1 ml。当SGC7901细胞与TGZ共同培养72 h后，取出6孔板内的玻片，4%多聚甲醛固定5～10 min，取出晾干，干燥彻底后即可进行苏木精-伊红染色，观察形态学改变。 1.2.4 免疫组织化学染色及Western blot 检测TGZ作用72h后SGC7901细胞PPARγ表达 1.2.4.1 免疫组织化学染色步骤 用1640培养液稀释肿瘤单细胞悬液浓度至2×108/L，以每孔1 ml单细胞悬液接种于6孔板中，培养板每孔内放置3枚直径10 mm的圆形盖玻片。按照上述实验分组设计，每组每孔分别加入含有TGZ的培养液各1 ml。当SGC7901细胞与TGZ共同培养72 h后，取出6孔板内的玻片，4%多聚甲醛固定5～10 min，取出晾干，干燥彻底后即可进行免疫细胞化学染色(SP法)。PPARγ一抗稀释浓度1∶300，PPARγ表达的判定以细胞核中有明显棕黄色或棕褐色颗粒者为阳性细胞；光镜高倍镜下观察，随机选取10个视野，共计1000个细胞中的阳性细胞数（即阳性细胞占计数细胞的百分比）。 1.2.4.2 Western blot检测 将对数生长期的SGC7901细胞消化，吹打成单细胞悬液，计数，调整细胞终浓度为2×108/L，置于100 ml培养瓶中，每瓶10 ml，待细胞贴壁生长后，弃上清，按照上述实验分组，加药作用72 h后收集细胞，提取总蛋白，蛋白定量后进行SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE ），转膜后加入含羊抗人PPARγ多克隆抗体（1∶500稀释）的一抗封闭液，置摇床上30 min，4℃过夜，次日漂洗封闭后加入碱磷酶标记兔抗羊IgG（1∶2000稀释）的封闭液，置摇床上晃动2 h后漂洗，NBT/BCIP显色液显色，观察蛋白表达的改变。 1.2.5 流式细胞术检测细胞凋亡和细胞周期 用RPMI 1640培养液稀释肿瘤单细胞悬液浓度至2×108/L，以每孔1 ml单细胞悬液接种于24孔板中于37℃、5%CO2培养箱内培养，待细胞贴壁后，按照上述实验分组设计，每组每孔分别加入含有TGZ的培养液各1 ml，培养48 h、72 h后，收集细胞，70%冰乙醇固定，PI染液染色后采用Beckon/Dickinson FACS Calibur型流式细胞仪进行流式细胞术检测，在488 nm波长处进行检测，记录激发波长493 nm处的红色荧光。检测细胞凋亡与细胞周期改变。 1.3 数据处理 实验结果采用Stata8.0软件进行统计分析。各组数据均以±s表示，采用单因素方差分析，并采用Scheffe法分析组间差异。检验水准：α=0.05。 2 结 果 2.1 PPARγ在胃癌中表达 在轻度不典型增生、重度不典型增生及胃癌标本中，PPARγ阳性表达率为15.15％（5/33）、66.67％（14/21）、71.43％（60/84），轻度不典型增生与重度不典型增生及胃癌组间有统计学差异（P＜0.05） ，重度不典型增生与胃癌组之间未见统计学差异。 2.2 体外实验结果 2.2.1 MTT法检测应用TGZ对胃癌SGC7901细胞的生长的影响 SGC7901细胞与不同浓度的TGZ共同培养，细胞的生长受到不同程度的抑制，当药物作用48 h，TGZ浓度达50 μmol/L及以上时，与对照组相比P＜0.05，同时其作用具有浓度及剂量依赖性（表1）。 表1 TGZ作用48、72 h后对SGC7901细胞抑制作用与0 μmol/L组比较:△P<0. 05 2.2.2 形态学观察TGZ对胃癌SGC7901细胞的影响 SGC7901细胞与TGZ共同培养72 h，实验组肿瘤细胞的生长较阴性对照组逐渐稀疏，细胞体积变小、形态不规则、细胞皱缩、核固缩、胞浆空泡等形态学表现（图 1）。图1 TGZ作用SGC7901 后形态学表现（苏木精-伊红染色，10×40）